使用免疫亲和蛋白质组学进行PTM肽段的相互作用网络与通路分析

Jeffrey C. Silva1; Stuart Tugendreich2; Hongbo Gu1; Charles L.Farnsworth1; Kimberly A. Lee1; Xiaoying Jia1; Jian Min Ren1; Matthew P. Stokes1
1Cell Signaling Technology, Danvers MA USA01923; 2Ingenuity Systems

Introduction

蛋白质翻译后修饰在细胞信号通路传递中扮演了涵盖蛋白活性调控、稳定及亚细胞定位等方面重要角色。Cell Signaling提供基于抗体技术的翻译后修饰位点（包括磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化等）、共motif激酶底物及来自同一个或多个信号通路的蛋白质肽段的富集方法。这些抗体技术使用免疫亲和纯化富集来自于细胞系、组织、移植物或其他生物材料中的翻译后修饰肽段，然后联用LC-MS/MS技术鉴定数千种以上的翻译后修饰肽段。最后我们采用Ingenuity^® Systems 的通路分析软件IPA^® 对这些大数据集进行生物信息学的整合与分析。

Methods
使用了Cell Signaling Technology^®的Acetyl-Lysine, Mono-Methyl-Arginine, or Ubiquitin Branch 抗体对HCT-116人大肠癌细胞系和小鼠肝脏组织进行了后修饰肽段富集并用PTMScan^® 进行位点分析 (Rush et al. 2005, Lee et al. 2011, Kim et al. 2011)。样品分析使用LTQ-Orbitrap^®VELOS 或Elite LC-MS/MS，搜库使用Sorcerer (Lundgren et al. 2009)。鉴定结果导入Ingenuity^®Systems IPA^®软件包进行分析。所有富集得到的翻译后修饰肽段对应的蛋白采用Core analysis进行分析，背景数据库采用Ingenuity Knowledge Base中所有基因和内源性化合物库，所有相互作用分析限制在实验发现或高可信度预测的直接相互作用。

Figure1: PTMScan方法: 免疫亲和纯化实验流程，采用motif特异抗体富集acetylated (AcetylScan^®), methylated (MethylScan)和ubiquitinated (UbiScan^®) 肽段。

Figure2: 使用Acetyl-lysine, Mono-methyl-Arginine, and Ubiquitin Branch motif抗体进行PTMScan^®分析结果. 
A. 每类抗体鉴定到的非冗余位点/蛋白数量。B.面积百分比Venn图展示了蛋白鉴定数，每类抗体（黑色数字）和抗体间的交盖度（白色数字）。C. 每类抗体富集蛋白的蛋白类型排名前七的结果。信息来自PhosphoSitePlus^®数据库。
IPA^® Canonical Pathways: 将鉴定到的蛋白映射到IPA经典通路数据库

IPA^® Network分析: 由鉴定到的蛋白预测的De novo 通路

Figure 4: 每类抗体富集蛋白排名前三的IPA^®相互作用网络(A =Acetyl, B = Methyl, C =Ubiquitin)。相互作用网络间的共同分子由网络节点间的连线注明。

Conclusion
Ingenuity^® Systems IPA^® 软件提供了一个深入挖掘由PTMScan^®技术抗体富集Acetyl-Lysine,Mono-Methyl-Arginine, and Ubiquitin-Branch motif得到的后修饰蛋白的相互作用网络和通路信息。

References
1.Rush, J. et. al. (2005) Nat. Biotechnol. 23, 94–101.
2.Lee, K. A. et. al. (2011) J. Biol. Chem. 286(48):41530–41538.
3.Kim, W. et. al. (2011) Mol. Cell. 2011 Oct 21;44(2):325–340.
4.Lundgren, D. H. et. al. (2009) Curr. Protoc. Bioinformatics Chapter13, Unit 13 13.