摘要
心脑血管疾病具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，丹红注射液对心脑血管的治疗的作用机制尚不清楚。本案例采用IPA进行网络药理学分析，并进行实验验证，共同揭示丹红注射液“脑心同治”的作用机制。

背景
心脑血管疾病具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。随着心脑血管疾病研究的深入，脑、心疾病之间的相关性研究得到越来越多的到关注。缺血性中风和冠心病是发病最多、最具典型的心脑血管疾病，其共同发病原因包括：炎症、免疫、血栓形成、脂代谢和凋亡等，其中系统炎症和免疫反应的作用尤为重要[1]。丹红注射液主要由丹参、红花组成，具有活血化瘀，通脉舒络的功效。用于治疗瘀血闭阻所致的胸痹及中风等病症。在临床上常用于治疗缺血性中风和冠心病等疾病，但其共同的作用机制尚不清楚。本文采用网络药理学分析和实验验证相结合方法，来揭示丹红注射液“脑心同治”的共同作用机制。

 

脑-心相关性[1]

表1 丹红注射液治疗中风和冠心病的临床调查

全文思路和流程

  本研究主要分为四部分：建立数据库；建立网络；分析网络；实验验证，如图1。

 

图1 研究思路和流程

方法
1，数据库建立
      建立三个数据库：通过整合（Ingenuity Pathway Analysis）IPA，OMIM，CADgene，NCBI-gene，GeneCards，MalaCards等数据库获得疾病相关的靶标；通过文献挖掘及整合TCMSP，TCM Database@Taiwan，TCMID，TCMGeneDIT等数据库得到中药所含的化合物；通过整合IPA，TCMSP，TCMID等数据库得到化合物对应的靶点。

2，网络建立和分析
      将上述建立的三个数据库分别导入IPA中，建立“成分-靶标-疾病&功能-通路”网络。通过核心分析，经典通路分析，功能分析，上游调控因子分析等功能进行数据的聚类和切入点的发现。

3，实验验证
      通过基于高内涵的核转位及Western blotting，ELISA等方法验证分析结果。通过基于高内涵活性筛选的方法筛选活性化合物并验证网络分析的准确性。

结果
1，丹红“脑心同治”共同靶标鉴定
将建立的数据库导入IPA进行可视化，共得到494个中风和371个冠心病相关靶标及149个共同靶标，如图2A。丹红中主要成分与这些靶标作用以后，共得到101个中风和162个冠心病相关靶标及68个共同靶标，如图2B。

图2 丹红治疗中风和冠心病的共同靶标。（A）中风和冠心病靶标及共同靶标；（B）丹红注射液可干预的中风和冠心病靶标及共同靶标。

2，丹红“脑心同治”的“成分-靶标-疾病&功能-通路”网络建立及分析
      进而以丹红“脑心同治”68个共同靶标为核心进行网络的建立和分析。“成分-靶标”网络展示了37个丹红成分（其中丹参中20个，红花中23个，共同成分6个）和68个靶标之间的作用关系，如图3A；“靶标-疾病&功能-通路”网络展示了68个靶标和排名前10的疾病，排名前10的功能，排名前20的通路之间的作用关系，如图3B。根据-log（p-value）值对得到的疾病和功能进行相关性排序，排名第一的疾病为动脉粥样硬化（atherosclerosis），如图3C；排名第一的功能为炎症反应（inflammatory response），如图3D。进而我们根据疾病或功能将得到的通路分为6类并进行排序，如图3E。排名第一的为动脉粥样硬化通路（atherosclerosis signaling），如图3F；排名第二的为HGMB1 signaling，如图3G。

  根据上述得到的结论，进而在丹红“脑心同治”68个共同靶标中摘出50个与炎症反应相关的分子，如图4A；并进行上游调控因子分析，排名前20的上游调控因子，如表2。基于68个共同靶标，建立与炎症反应和动脉粥样硬化都相关的分子网络，如图4B。结合20个上游调控因子综合分析，最终共得到6个核心分子，分别为三个炎症因子：IL1B (IL-1β)，TNF (TNF-α)，IL10 (IL-10)和三个转录相关因子：RELA (NF-κB)，JUN (c-jun)，MAPK 14 (p38 MAPK)，其相互作用关系，如图4C。丹红成分调控6个分子的网络，如图4D。

图3 丹红“脑心同治”网络建立及分析。（A）成分-靶标网络；（B）靶标-疾病&功能-通路网络；（C）相关疾病排序；（D）相关功能排序；（E）相关通路排序；（F）atherosclerosis signaling（G）HGMB1 signaling。

 

图4 丹红作用于炎症和动脉粥样硬化相关的关键上游调控因子。（A）68个共同靶标中于炎症反应相关的靶标；（B）68个共同靶标中与炎症反应和动脉粥样硬化都相关的靶标；（C）6个核心上游调控因子；（D）丹红成分与6个核心上游调控因子的作用网络。

表2 上游调控因子分析

 

4，丹红注射液逆转脂多糖（LPS），氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），胆固醇晶体（CHC）诱导的c-Jun，p38 MAPK，NF-κB p65核转位
      炎症反应参与动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的始终，抗内皮炎症是治疗ASCVD的关键点。基于上述网络分析得到关键的3个转录相关因子，进而选用动脉粥样硬化发生和发展过程中与炎症反应相关的三个诱导剂LPS，ox-LDL，CHC诱导内皮细胞c-Jun，p38 MAPK，NF-κB p65的核转位，并对比丹红注射液干预后的效果。结果显示，丹红注射液能够呈剂量依赖性的抑制LPS，ox-LDL诱导的c-Jun，p38 MAPK，NF-κB p65的核转位，如图5。

图5 丹红注射液在不同激动剂诱导的c-Jun，p38 MAPK，NF-κB p65的核转位中的作用。（A和B）丹红注射液在LPS诱导的c-Jun，p38 MAPK，NF-κB p65的核转位中的作用；（C和D）丹红注射液在ox-LDL诱导的c-Jun，p38 MAPK，NF-κB p65核转位中的作用。（E）CHC诱导的c-Jun，p38 MAPK，NF-κB p65核转位。

5，丹红注射液逆转LPS，ox-LDL，CHC诱导的JNK, p38 MAPK, NF-κB p65磷酸化
      为了验证丹红注射液在核转位中的抗炎作用，进而评价JNK, p38 MAPK, NF-κB p65在不同诱导剂LPS，ox-LDL，CHC刺激下的磷酸化水平。结果显示，丹红注射液能有呈剂量依赖性的抑制LPS，ox-LDL，CHC诱导的JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化，如图6。其结果与核转位部分的结果基本一致。

 

图6 丹红注射液在不同激动剂诱导的JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用。（A和D）丹红注射液在LPS诱导JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用；（B和E）丹红注射液在ox-LDL诱导JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用；（C和F）丹红注射液在CHC诱导JNK, p38 MAPK, NF-κB p65蛋白磷酸化中的作用。

6，丹红注射液逆转LPS，ox-LDL，CHC诱导的炎症因子IL-1β，IL-10，TNF-α分泌
      基于上游调控因子分析，得到的三个关键炎症相关分子：IL-1β，IL-10，TNF-α。仍选用LPS，ox-LDL，CHC来诱导其分泌，并验证丹红注射液对其作用。结果表明：丹红注射液能够不同程度的抑制LPS，ox-LDL，CHC诱导IL-1β分泌；丹红注射液能够不同程度的促进LPS，ox-LDL诱导IL-10分泌；丹红注射液能够不同程度的抑制LPS，ox-LDL，CHC诱导的TNF-β分泌，如图7。

 

图7 丹红注射液在不同诱导剂诱导的炎症因子IL-1β，IL-10，TNF-α分泌中的作用。（A-C）丹红注射液在LPS，ox-LDL，CHC诱导IL-1β分泌中的作用；（D-F）丹红注射液在LPS，ox-LDL，CHC诱导IL-10分泌中的作用；（G-I）丹红注射液在LPS，ox-LDL，CHC诱导TNF-α分泌中的作用；

7，丹红注射液抗炎活性成分筛选
为了进一步验证网络分析的准确性，采用基于高内涵的高通量活性筛选方法。选用LPS诱导的内皮细胞NF-κB p65（RELA）核转位为模型，对以RELA为靶标的丹红中14个成分进行筛选。最终共得到10个具有显著抑制LPS诱导的RELA核转位的活性成分，如图8。同时也从一定程度上验证了网络分析的准确性。

 

图8 丹红抗内皮炎症活性筛选。（A）丹红中可作用于RELA分子的成分（B）；丹红中14个成分抗LPS诱导的RELA核转位活性筛选；（C）以Apigenin（芹菜素）为实例的核转位细节展示。

结论
丹红注射液通过多分成，多靶点，多通路，多功能方式发挥“脑心同治”作用。抗内皮炎症为丹红注射液“脑心同治”的主要共同机制。本研究为今后丹红注射液在临床治疗心脑血管疾病提供新的参考依据。

参考文献：
1. Chen, Z.; Venkat, P.; Seyfried, D.; Chopp, M.; Yan, T.; Chen, J. Brain-heart interaction: Cardiac complications after stroke. Circulation research 2017, 121, 451-468.

原文：
Lyu, M.; Yan, C.L.; Liu, H.X.; Wang, T.Y.; Shi, X.H.; Liu, J.P.; Orgah, J.; Fan, G.W.; Han, J.H.; Wang, X.Y., et al. Network pharmacology exploration reveals endothelial inflammation as a common mechanism for stroke and coronary artery disease treatment of danhong injection. Scientific reports 2017, 7, 15427.

博士研究生吕明和严春琳为共同一作。朱彦教授为通讯作者，天津中医药大学为第一单位。

致谢：
本文为第一作者吕明撰写，文章条理清晰，充分突出了IPA在进行分子网络模拟中的作用，源资科技在此非常感谢作者对IPA软件的支持，也欢迎各界IPA用户投稿。