背景：
在衰老过程中，成骨细胞的功能缺失是成骨失衡和衰老引起的骨流失的关键因子。本文旨在对比正常和衰老的成骨细胞（osteoblasts）挖掘出差异表达基因，从而能够寻找到在衰老过程中的骨质改变相关的基因。本文基于二代测序技术和生物信息学分析方法，鉴定出12个差异表达的microRNA和22个差异表达基因。其中在髋部骨质疏松性骨折的数据集GSE74209中，miR-204-5p被证实为上调表达。经查询，miR-204-5p的潜在靶基因为KLF7（Kruppel-like factor 7）和SOX11（SRY-box 11）。通过使用IPA进行挖掘发现，SOX11参与了骨关节炎通路和成骨细胞分化过程，结合潜在的上游调节因子miR-204-5p，诠释了miR-204-5p-SOX11在人类衰老过程中骨质变化的调节作用。此外，SEMA3A (semaphorin 3A) 和EPHA5 (ephrin type-A receptor 5)参与了神经系统相关的生物学功能，本文假设SEMA3A 和EPHA5之间有潜在联系可能会参与神经源性异位骨化的生物学过程。综上，本文发现了老年肌肉骨骼疾病诊段的新的候选基因，并且提出神经源性异位骨化的新的生物标志物。
实验及数据分析方法：
采用P1和P8代的成骨细胞系（osteoblasts）分别进行mRNA和microRNA的测序。从中选择显著表达差异的microRNA并且寻找其潜在的靶标mRNA并使用IPA进行表达量的配对分析（“microRNA-mRNA campare dataset” tool）进行mRNA的筛选。并且对寻找到的基因列表进行功能网络挖掘和通路挖掘，寻找潜在的biomarker。
分析结果：
图一：（A）通过测序获得的microRNA表达值采用阈值为|FC|>2, RPM>10获得了10个上调的microRNAs和19个下调的microRNAs。使用miRmap进行microRNA的靶标mRNA预测打分（score>=99.0），获得上调的microRNAs共有381个潜在靶标mRNA，而下调的microRNAs共有606个潜在靶标mRNA。使用IPA能够mapped识别上调的microRNAs共有378个潜在靶标mRNA，而下调的microRNAs共有599个潜在靶标mRNA。之后，再使用IPA的microRNA-mRNA配对分析，根据mRNA的表达值（|FC|>2）找到了 ，当microRNAs上调时共有356个靶标mRNA下调，而下调的microRNAs共有399个潜在靶标mRNA上调表达。其中有22个microRNA-mRNA存在于本文的实验NGS数据中（表一所示）。（B）差异表达的29个microRNA在P1和P8的osteoblasts样本中的表达热图（z-Score）。
表一. 使用IPA的microRNA-mRNA配对分析挖掘出的22个microRNA-mRNA关系列表及基因表达值。
图二： 将表一中5个上调的microRNA（A）和7个下调的microRNA（B）在髋部骨质疏松性骨折的数据集GSE74209的表达值，发现miR-204-5p（上调）和miR-335-3p（下调）在这一数据样本中具有显著的表达值。根据表一，得到了miR-204-5p的靶标基因KLF7 和SOX11，以及miR-335-3p的靶标基因KIAA1462和SVIP共四个基因。
表二. 将表一中找到的22个基因直接上传到IPA进行NETWORK网络分析，得到了三个网络，经过打分，其中有两个网络得分较高。这三个网络分别参与了cancer, organ injury and abnormality, tissue morphology, endocrine system disorders, cellular development, cell-mediated immune response and cellular movement等疾病或生物学功能。其中，经过图二发现的四个基因中有三个都共存于网络二中。
图三：IPA的NETWORK网络分析中的Network 2的分子网络结构图。
图四：将miR-204-5p作为潜在的上游调节因子进行数据集的分析。使用IPA的overlay功能，能够看到这些分子参与了canonical osteoarthritis pathway, Wnt/β-catenin pathway这两个通路，并且图中紫色标识的分子参与了differentiation of osteoblasts功能。图中能看到SOX11 同时参与了这两个通路和这一生物功能。
表三.将图四中的miR-204-5p及其下游分子导入到IPA进行功能分析，发现ALPL, CYP1B1, EGR1, GREM1, IGFBP5, PRDM1和SOX11 参与了differentiation of osteoblast and muscle cells, bone mineralization and mineral density, 以及osteoclastogenesis等生物学功能。
图五：将NGS数据的差异表达基因导入到IPA进行分析，挖掘出25个分子网络。从中间挑出skeletal diseases and functions annotation功能, 包括bone mineral density, differentiation of osteoblasts, osteoarthritis and damage of cartilage tissue这三个功能网络联合做图，寻找潜在的相关基因。其中可以看到SOX11 是networks of osteoblast differentiation和bone mineral density连接分子，并且预测其能够抑制EGR1 且激活PRDM1这两个参与bone mineral density网络的分子。
图六：将表二中的network1用IPA的overlay功能进行经典通路分析，可以看到EPHA5和 SEMA3A参与了axon guidance pathway。
总结：
使用IPA进行microRNA-mRNA配对分析，能够方便有效的锁定microRNA和mRNA。并且能够提供后续的分子功能以及通路分析。除此之外，IPA还能够提供多角度的分析报告，适用于研究人员快速进行RNA-seq，small RNA-seq和蛋白组学的深入数据挖掘。
原文文献：
Chen, Y. J., Chang, W. A., Huang, M. S., Chen, C. H., Wang, K. Y., & Hsu, Y. L., et al. (2017). Identification of novel genes in aging osteoblasts using next-generation sequencing and bioinformatics. Oncotarget, 8(69), 113598-113613.
