1.前言
二酰甘油（DAG）在二酰甘油激酶α（DGKa）催化下，发生磷酸化反应，生成磷脂酸（PA）。这两种分子是人体中的第二信使，调节许多生理过程：细胞增殖和运动、免疫反应、葡萄糖代谢和心血管反应等。二酰甘油激酶家族能有效的控制二酰甘油和磷脂酸在细胞中的浓度，并且该酶上调或下调会引发癌症、癫痫、帕金森等疾病。二酰甘油激酶家族有十种亚型，其中α亚型是研究最多的。二酰甘油激酶α在中枢神经系统、脾脏、胸腺、T细胞、肺等组织中都有表达，研究发现该酶是抗癌药物发现的重要靶标。研究还发现二酰甘油激酶α在肝癌细胞、黑色瘤细胞中过量表达，其抑制剂可以有效地杀死癌细胞、增强免疫细胞T细胞的活性。
DGKa过量表达会影响疾病X-连锁淋巴组织增生症1型（XLP-1）的病情。XLP-1是由淋巴信号活化分子相关蛋白（SAP）基因突变所致，该病会导致各种免疫细胞功能改变，尤其是CD8+ T细胞、NK细胞和NKT细胞的细胞毒性作用减弱，从而诱发致死性噬血淋巴组织细胞增生症（HLH）或爆发性传染性单核细胞增生症（FIM），会引发患者血细胞减少、肝功能衰竭、肝脾肿大、淋巴组织细胞增生症等症状。该病一旦发生，如未经造血干细胞移植（HSCT），死亡率极高。目前发现的DGKa抑制剂较少，并且一些抑制剂还表现出选择性低、药代动力学性质差等特点。化合物R59949和R59022是靶向DGKa的选择性抑制剂，但是也表现出较差的药代动力学性质，如半衰期短、脱靶等。由于没有DGKa晶体结构，所以本研究使用化合物R59949和R59022作为模板来进行2D/3D相似性筛选发现新型抑制剂。
图1 筛选流程
研究选择已知抑制剂R59949和R59022作为模板筛选ZINC数据库。首先对ZINC数据库中的630万个化合物进行PAIN筛选，筛除假阳性化合物后得到300万个化合物，接着对数据库中的这些化合物进行构像采样，以得到它们的最低能量构象。同时对模板分子R59949和R59022进行构像采样。使用模板分子的最低能量构象去筛选数据库，经过形状相似性筛选、静电相似性筛选后，得到106个符合条件的化合物。
3.1 虚拟筛选结果
研究选择化合物R59949和R59022为模板进行2D/3D相似性筛选。采用2D指纹方法进行2D相似性筛选，结果从PubChem数据库中发现了5个2D指纹相似性较大的化合物。同时研究还进行了3D相似性筛选，主要使用形状相似性（ROCS）、静电相似性（EON）来筛选ZINC数据库。研究选择形状相似性较大的前1000个化合物继续进行静电相似性筛选，得到静电相似性较大的前150个化合物。其中虚拟筛选发现的化合物AMB639752和模板分子的结构骨架差异较大，但是它们有相似的3D结构，形状相似性值为0.623。同时化合物AMB639752与模板分子R59949的静电相似性值高达0.745。购买这些命中的化合物进行生物活性测定。
图2 命中化合物的静电势能图
3.2 活性测定结果
研究使用DMSO溶解化合物，然后进行细胞活性测定。实验选择的细胞珠系为能稳定表达OST-DGKa的Madin-Darby犬肾细胞。实验测定了命中的127个化合物的生物活性，其中17个化合物表现出25%的抑制率。模板化合物R59949和R59022的抑制率分别为72%和73%。虚拟筛选发现的化合物ritanserin和AMB639752表现出比模板化合物还要高的抑制率。研究还测定了这些命中化合物抑制OST-DGKa的IC50值，模板化合物R59949和R59022抑制DGKa酶的IC50值分别为10.6 ± 3.2 mM 和 19.7 ± 3.0 mM 。虚拟筛选命中的化合物ritanserin和AMB639752的抑制中浓IC50值分别为16.7 ± 4.6 mM 和4.3 ± 0.6 mM 。虚拟筛选命中的两个新化合物表现出比模板分子还要高的抑制活性，可以作为抑制DGKa酶的先导化合物进行后期研究。
研究还测定了DGKa酶沉默后引发的一系列基因产物的变化，测定结果同样表明虚拟筛选发现的新化合物AMB639752能特异性抑制DGKa酶的活性，并且可以有效治疗XLP-1病。
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通过虚拟筛选和生物活性测定发现了几个用于治疗XLP-1病症的DGKa特异性抑制剂，有望在未来进入临床试验阶段。本研究主要是以抑制剂分子R59022和R59949作为模板进行形状相似性筛选、静电相似性筛选，从ZINC数据库中发现了127个3D形状和静电性质与模板分子相似的化合物。对命中化合物进行生物活性测定，发现命中的化合物ritanserin和AMB639752对靶酶DGKa的抑制中浓IC50值比模板分子的小，抑制活性较好。各种生物活性测定结果表明新化合物AMB639752有望发展成XLP-1病的治疗药物。
使用模块：OMEGA、ROCS、EON
参考文献
1.Velnati S , Ruffo E , Massarotti A , et al. Identification of a novel DGKα inhibitor for XLP-1 therapy by virtual screening[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2019, 164:378-390.
