1.研究背景
细胞色素c氧化酶（CcO）是真核生物线粒体内膜和需氧菌细胞膜电子传递链上的终端酶。它承担着细胞色素c到氧分子的电子传递功能，催化氧分子还原为水分子，并与质子泵功能相偶联。催化反应式如下：
4cyt c (Fe2+) + 8H+ + O2 = 4cyt c (Fe3+) + 4H+ + 2H2O
形成水所需要的质子来源于细菌或线粒体内膜的内侧，而cyt c则位于内膜的外侧。这种底物间的隔离造成了电化学质子梯度的产生。另外CcO还有一种质子泵机制，即在传递电子的同时，每个反应循环中伴随着4个质子由膜内侧泵向外侧。这样，进一步加剧了质子电化学梯度的产生。生物体就是利用这种质子电化学梯度推动ATP合成的，ATP是许多生理过程必需的直接能源。因此，CcO在生物体的代谢过程中至关重要。
本研究靶向CcO进行新型抑制剂的发现，以期得到抑制细胞色素c氧化酶活性的新型化合物，从而调控生物体的代谢过程。
2.研究流程
图1 筛选流程
研究首先对筛选数据库中的化合物进行了预处理，然后基于已知抑制剂的化学特征进行相似性筛选，和假阳性筛选。最后命中的化合物进行酶活性测定。
3.研究结果
细胞色素c具有封闭结构，会阻止小分子与其结合。研究首先分析了97个细胞色素c氧化酶的PDB结构，发现结构的部分原子坐标发生了波动，但是所有结构均处于封闭状态。进行200 ns的动力学模拟后，蛋白质结构仍是封闭状态。
经过动力学模拟优化蛋白质结构以后，基于抑制剂与蛋白的结合构象来产生ROCS的提问模型（图2）。然后对预处理好的数据库，进行形状相似性筛选、假阳性筛选，最后命中形状相似性较好的能成药的12个化合物。
研究对命中的12个化合物进行了抑制过氧化物酶活性测定的实验。活性测定结果发现有3个化合物表现出了较强的过氧化物酶抑制活性，4个化合物表现出中等抑制活性，5个化合物没有抑制活性。继续分析3个较高活性的化合物，发现联苯苄唑（bifonazole）和益康唑（econazole）是抗真菌药物，主要靶向细胞色素P450蛋白。命中化合物阿比特龙（abiraterone）是细胞色素17A1（CYP17A1）酶的抑制剂。本研究发现这3个化合物可以用于抑制细胞色素过氧化酶活性，这为新型药物的发现研究提供了指导。
表1 命中化合物的相似性分值和抑制活性
图2 提问结构与命中的化合物结构
4.结论
研究基于已知抑制剂的化学特征和靶标蛋白活性口袋的形状特点进行筛选。从ZINC数据库中筛选到了7个对细胞色素c氧化酶有抑制活性的化合物，其中有4个化合物的抑制活性与抑制剂TPP-6-ISA相似，化合物L254614表现出的抑制活性最好，完全抑制了细胞色素c氧化酶的活性。通过分析化合物L254614的结构，发现其有较多环状结构，并且含硫七聚环，因此表明刚性结构能表现出较高的生物活性。分析命中化合物的理化性质，发现亲脂性（log P）高的化合物，更容易与活性口袋附近的血红素铁形成相互作用。假阳性筛选结果表明命中化合物都符合成药性，具有成药前景。
研究命中的化合物中，4个化合物表现出较好的过氧化物酶抑制活性，6个化合物表现出的抑制活性与抑制剂三苯基磷酸咪唑硬脂酸的活性相似，能有效抑制细胞的促凋亡氧化，防止细胞死亡。该先导物的发现过程为下一步的结构改造研究提供了指导。
使用模块：
OMEGA
vROCS
参考文献：
1. Bakan A , Kapralov A A , Bayir H , et al. Inhibition of Peroxidase Activity of Cytochrome c: De Novo Compound Discovery and Validation[J]. Molecular Pharmacology, 2015, 88(3):421-427.
